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Submesoscale characteristics and transcription of a fatty acid elongase gene from a freshwater green microalgae, Myrmecia incisa Reisigl 认领 引用 被引量：5
1
作者 于水燕 刘士成 +1 位作者 李春阳 周志刚 《Chinese Journal of Oceanology and Limnology》 CSCD 2011年第1期87-95,共9页
Myrmecia incisa is a green coccoid freshwater microalgae, which is rich in arachidonic acid （ArA, C20： 4ω-6, △5, 8, 11, 14）, a long chain polyunsaturated fatty acid （PUFA）, especially under nitrogen starvation ... Myrmecia incisa is a green coccoid freshwater microalgae, which is rich in arachidonic acid （ArA, C20： 4ω-6, △5, 8, 11, 14）, a long chain polyunsaturated fatty acid （PUFA）, especially under nitrogen starvation stress. A cDNA library of M. incisa was constructed with λ. phage vectors and a 545 nt expressed sequence tag （EST） was screened from this library as a putative elongase gene due to its 56% and 49% identity to Marchantia polymorpha L. and Ostreococcus tauri Courties et Chretiennot-Dinet, respectively. Based upon this EST sequence, an elongase gene designated MiFAE was isolated from M. incisa via 5＇/3＇ rapid amplification of cDNA ends （RACE）. The cDNA sequence was 1 331 bp long and included a 33 bp 5＇-untranslated region （UTR） and a 431 bp 3＇-UTR with a typical poly-A tail. The 867 bp ORF encoded a predicted protein of 288 amino acids. This protein was characterized by a conserved histidine-rich box and a MYxYY motif that was present in other members of the elongase family. The genomic DNA sequence of MiFAE was found to be interrupted by three introns with splicing sites of Introns I （81 bp）, II （81 bp）, and III （67 bp） that conformed to the GT-AG rule. Quantitative real-time PCR showed that the transcription level of MiFAE in this microalga under nitrogen starvation was higher than that under normal condition. Prior to the ArA content accumulation, the transcription of MiFAE was enhanced, suggesting that it was possibly responsible for the ArA accumulation in this microalga cultured under nitrogen starvation conditions. 展开更多
关键词 Myrmecia incisa fatty acid elongase transcription nitrogen starvation arachidonic acid （ArA）
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外源的微藻DGAT基因表达对酿酒酵母生长和脂质的影响 认领 引用 被引量：1
2
作者 胡澄溪 刘伟 +1 位作者 毕燕会 周志刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2025年第5期41-49,共9页
【目的】三酰甘油(TAG)合成缺陷型酿酒酵母突变株H1246常用于其他生物二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因功能鉴定。为了解外源DGAT的基因表达对酵母细胞脂质及生长的影响。【方法】将缺刻缘绿藻1个Ⅰ型和3个Ⅱ型的DGAT分别转化H1246菌株... 【目的】三酰甘油(TAG)合成缺陷型酿酒酵母突变株H1246常用于其他生物二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因功能鉴定。为了解外源DGAT的基因表达对酵母细胞脂质及生长的影响。【方法】将缺刻缘绿藻1个Ⅰ型和3个Ⅱ型的DGAT分别转化H1246菌株,经筛选获得tDGAT1、tDGAT2A、tDGAT2B及tDGAT2C等4株转目的基因酵母。通过显微观察、分光光度法、重量法、棒状色谱分析、气相色谱-质谱分析对酿酒酵母的形态和脂滴、细胞密度、单位体积生物量、生物质生产率、总脂、总脂肪酸、TAG含量进行检测。【结果】稳定生长期时的显微观察结果显示,这4个外源基因均能使H1246菌株恢复TAG的合成和贮存能力,进而在细胞中出现油滴。油脂分析结果表明,tDGAT1菌株的TAG及脂肪酸含量最高,且显著高于野生型Scy62及其他3株转目的基因菌株的水平。生长性能数据显示,4个外源基因均能使H1246菌株的细胞密度达到Scy62的水平,这可能是由于TAG的合成消耗了游离脂肪酸,以减轻其对细胞产生的伤害所致。但tDGAT1菌株的生长迟滞期明显延长,以致其生长速率最低。【结论】将缺刻缘绿藻不同类型的外源DGAT转化酿酒酵母后,使后者的生长性能及脂质含量产生不同的变化。该结果为利用基因工程改造酵母菌株以生产人类所需要的目的油脂研究奠定了基础。 展开更多
关键词 酿酒酵母 缺刻缘绿藻 二酰基甘油酰基转移酶(DGAT) 三酰甘油(TAG) 生长
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氮饥饿与磷饥饿促使缺刻缘绿藻花生四烯酸含量增加的比较 认领 引用 被引量：21
3
作者 童牧 于水燕 +1 位作者 欧阳珑玲 周志刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期763-773,共11页
以富含花生四烯酸(AA)的缺刻缘绿藻H4301为研究对象,探讨了不同光照强度条件下氮饥饿与磷饥饿对藻生物量、AA及脂肪酸含量变化的影响。发现氮饥饿与磷饥饿均降低了藻类的生长速率与生物量,当在60μmol photons/(m2.s)的低光照强度下,磷... 以富含花生四烯酸(AA)的缺刻缘绿藻H4301为研究对象,探讨了不同光照强度条件下氮饥饿与磷饥饿对藻生物量、AA及脂肪酸含量变化的影响。发现氮饥饿与磷饥饿均降低了藻类的生长速率与生物量,当在60μmol photons/(m2.s)的低光照强度下,磷饥饿时的藻类平均生长速率最低[0.025 g/(d.L)],不足BG-11完全培养基中该藻生长速率的一半;氮饥饿与磷饥饿均能提高藻细胞总脂肪酸及AA的含量,但在低光照强度下磷饥饿的促进效果比较差;无论是完全培养基中还是饥饿处理时,200μmol photons/(m2.s)的高光照强度都不利于藻细胞AA及多不饱和脂肪酸的合成与积累;随着饥饿时间的不断持续,AA占总脂肪酸的百分含量逐渐增加,而亚油酸的百分含量逐渐降低,但在磷饥饿时,油酸的百分含量也增加,特别在高光照强度下,以油酸为主的单不饱和脂肪酸含量在第27天时占细胞干重的5.28%,以致AA含量的增加没有氮饥饿时的显著。从脂肪酸成分的变化来分析,该藻在氮或磷饥饿过程中主要是从亚油酸到γ-亚麻酸再到20∶3ω6这个途径来合成并积累AA,其中Δ6去饱和酶是限速酶,而ω3去饱和酶催化步骤受饥饿处理的负调控对确保AA的合成与积累有较大的积极作用。氮饥饿使藻细胞蛋白质合成受阻以及磷饥饿使核酸合成、糖类与能量代谢产生障碍,从而阻止藻类的生长并迫使细胞代谢流转向不含氮和磷的脂肪酸合成代谢,以提高藻细胞总脂肪酸及AA含量。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 生物量 花生四烯酸(AA) 氮饥饿 磷饥饿
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缺刻缘绿藻FAD基因的序列特征及其相对转录量对氮饥饿的响应 认领 引用 被引量：3
4
作者 刘凡 李慧 +2 位作者 李春阳 欧阳珑玲 周志刚 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期729-740,共12页
为探讨缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)花生四烯酸(20:4 6,AA)合成过程中一系列脂肪酸去饱和酶(FAD)的作用,本研究克隆了12、6及5 FAD基因的cDNA全长序列(GenBank登录号分别为JN205757、JN205755和JN205756)及其相应的DNA序列。它们的cDNA... 为探讨缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)花生四烯酸(20:4 6,AA)合成过程中一系列脂肪酸去饱和酶(FAD)的作用,本研究克隆了12、6及5 FAD基因的cDNA全长序列(GenBank登录号分别为JN205757、JN205755和JN205756)及其相应的DNA序列。它们的cDNA全长分别为1 806 bp、2 674 bp及2 318 bp,其中ORF长为1 137bp、1 443 bp和1 446 bp,分别编码由378、480和481个氨基酸组成的蛋白;通过其cDNA与DNA序列的比对,发现12、6及5 FAD基因分别具有4、5和7个内含子,其剪切位点均符合"GT-AG"规则。Δ12、Δ6和Δ5 FAD编码蛋白均富含疏水性氨基酸,约占各自氨基酸组成的52.8%、46.6%及50.9%。密码子的偏好性与缺刻缘绿藻其他基因保持一致。推测这3个FAD基因编码蛋白都存在4个跨膜区,而12和5 FAD还各有一个明显不跨膜的疏水区;都具有FAD家族各自相对保守的3个组氨酸簇基序。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的FAD基因编码蛋白序列所构建的Neighbor-joining(NJ)系统进化树,表明Δ12、Δ6、Δ5及ω3 FAD分别隶属于各自的分支,其中,Δ12与ω3 FAD的亲缘关系较近,而Δ6与Δ5 FAD具有较近的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)分析这3个FAD基因在缺刻缘绿藻缺氮培养96 h后又恢复氮培养72 h过程中的相对转录量,结果表明这3个基因的相对转录量都受到氮信号的调控,它们随着氮饥饿培养时间延长明显上升,而氮恢复培养后迅速并显著地下降到氮饥饿胁迫前的水平。结合已知脂肪酸成分在此过程中的变化,推测这3个基因对缺刻缘绿藻AA的合成和积累都起着重要的作用,而Δ6 FAD的作用可能更关键。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 脂肪酸去饱和酶 基因克隆 实时荧光定量PCR 氮饥饿
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缺刻缘绿藻溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)的基因克隆与特征分析 认领 引用 被引量：1
5
作者 周志刚 包虹 欧阳珑玲 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期251-262,共12页
缺刻缘绿藻三酰甘油(TAG)中花生四烯酸(Ar A)占其总脂肪酸含量的68.0%。为了弄清Ar A是如何被优先地用于合成TAG,鉴于Lands循环是通过改变膜脂的脂肪酸组成进而影响TAG的脂肪酸组成,本研究选择在Lands循环中起关键作用的溶血磷脂酰乙醇... 缺刻缘绿藻三酰甘油(TAG)中花生四烯酸(Ar A)占其总脂肪酸含量的68.0%。为了弄清Ar A是如何被优先地用于合成TAG,鉴于Lands循环是通过改变膜脂的脂肪酸组成进而影响TAG的脂肪酸组成,本研究选择在Lands循环中起关键作用的溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)作为突破口。运用反转录PCR与3′-及5′-c DNA末端快速扩增技术,自缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)中克隆到MiLPEAT;它的c DNA序列全长1303 bp,其中,5′-非翻译区(UTR)长129 bp,3′-UTR长193 bp,开放阅读框长981 bp,编码326个氨基酸残基;以缺刻缘绿藻基因组DNA为模板扩增得到该基因长为1871 bp的DNA序列;这两序列的比对结果显示,MiLPEAT含有6个内含子,将其开放阅读框(ORF)分割成7个外显子。通过多序列比对及生物信息学分析,发现MiLPEAT存在一个磷酸酰基转移酶结构域Pls C,并含有LPEAT家族所具有的NH(x)4D、FPEGT等4个特征性模体;Wolfpsort等在线预测结果以及MiLPEAT羧基端存在的双赖氨酸模体"KKxx",暗示它可能位于内质网并参与分泌途径。基于不同植物LPEAT的氨基酸序列所构建的邻接聚类图表明,MiLPEAT因与2型LPEAT有不同的序列特征而形成不同的分支,但却与1型LPEAT聚类在一起,推测它们的功能可能更近似。通过荧光定量PCR检测,发现MiLPEAT的基因转录量在氮饥饿8 h时显著(P<0.05)增加;与其变化相应的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)相对丰度却极显著地(P<0.01)减少49%,但磷脂酰乙醇胺(PE)相对丰度的增加却不显著;推测在氮饥饿过程中增加的磷脂酰乙醇胺(PE)可能被磷脂:二酰甘油酰基转移酶作用以合成为TAG,致使缺刻缘绿藻TAG含量的增加。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT) 三酰甘油(TAG) 磷脂 氮饥饿
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缺刻缘绿藻cDNA文库的构建 认领 引用 被引量：1
6
作者 刘士成 杜道海 +1 位作者 张成武 周志刚 《上海水产大学学报》 北大核心 2008年第5期535-538,共4页
缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid，AA），是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA，然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法，构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库，测得... 缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid，AA），是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA，然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法，构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库，测得的原始文库滴度为6×10^6pfu／mL，随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定，扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb，平均插入片段长度约为1kb，文库的重组率达95．83％，说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 cDNA文库 花生四烯酸
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缺刻缘绿藻磷脂酶A2(PLA2)的基因特征与功能 认领 引用 被引量：2
7
作者 李斯琪 毕燕会 周志刚 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1042-1051,共10页
为进一步鉴定磷脂酶A2(PLA2)在缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)油脂合成过程中的具体功能,研究利用RACE技术从缺刻缘绿藻H4301中克隆到pla2基因(Mipla2)的cDNA序列全长,共1082 bp。该全长包含180 bp的5′-非翻译区(UTR),464 bp的3′-UTR和4... 为进一步鉴定磷脂酶A2(PLA2)在缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)油脂合成过程中的具体功能,研究利用RACE技术从缺刻缘绿藻H4301中克隆到pla2基因(Mipla2)的cDNA序列全长,共1082 bp。该全长包含180 bp的5′-非翻译区(UTR),464 bp的3′-UTR和438 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由145个氨基酸组成的蛋白。其基因全长为1594 bp,含有3个内含子和4个外显子。多序列比对结果显示,MiPLA2具有保守的Ca2+结合基序和催化活性基序。系统演化分析结果显示MiPLA2属于植物sPLA2-XIA家族。利用同源重组技术构建了pET32a-Mipla2原核表达载体,经过诱导和纯化,得到了分子量大小为31.36 kD的重组MiPLA2蛋白。体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiPLA2具有催化磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)的功能。研究结果有助于解析花生四烯酸被优先用于三酰甘油(TAG)合成的途径与机理,为通过pla2基因的遗传改造提高该藻油脂产率的应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 磷脂酶A2(PLA2) 基因克隆 大肠杆菌 异源表达 缺刻缘绿藻
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微藻异养/兼养生产多不饱和脂肪酸以及向卤虫的传递 认领 引用 被引量：3
8
作者 刘晓璐 孙诤 周志刚 《上海海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1373-1381,共9页
等鞭金藻(Isochrysis sp.)与缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)是具有极高营养价值的微藻,分别富含二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ArA),对这2种微藻的异养/兼养培养方式展开探索。在使用葡萄糖作为外源有机碳源时,等鞭金藻和缺刻缘绿藻均... 等鞭金藻(Isochrysis sp.)与缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)是具有极高营养价值的微藻,分别富含二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ArA),对这2种微藻的异养/兼养培养方式展开探索。在使用葡萄糖作为外源有机碳源时,等鞭金藻和缺刻缘绿藻均可以实现异养生长,在黑暗条件下快速积累生物量。适宜等鞭金藻和缺刻缘绿藻异养的葡萄糖质量浓度分别为5 g/L和1 g/L。在此基础上,继续探究氮质量浓度的影响:对于等鞭金藻,300 mg/L的硝酸钠对于生物量的生产最佳,同时对于胞内DHA积累的促进作用最强;对于缺刻缘绿藻,氮质量浓度对于微藻的生长影响不明显,但对其ArA的含量影响显著,缺氮培养时ArA的含量最高。在证实了两种微藻的异养特性与最适碳、氮营养供给后,进一步开展兼养研究,从而获得了显著提升的微藻生物量以及目标多不饱和脂肪酸的含量。最后,将兼养获得的2种微藻用于投喂卤虫,结果表明DHA与ArA都可以被有效传递给卤虫,从而有望开发成为营养强化型的水产饵料。本研究为等鞭金藻和缺刻缘绿藻的资源化利用提供了有价值的技术参考。 展开更多
关键词 等鞭金藻 缺刻缘绿藻 二十二碳六烯酸 花生四烯酸 卤虫
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缺刻缘绿藻碳酸酐酶(CA)基因的序列克隆及特征分析 认领 引用 被引量：1
9
作者 梅守华 毕燕会 周志刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期658-668,共11页
从缺刻缘绿藻的转录组数据库中搜索到5条编码该藻碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)的contig序列,据此序列设计基因特异性引物,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术,克隆得到c DNA全长序列,分别命名为M i... 从缺刻缘绿藻的转录组数据库中搜索到5条编码该藻碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)的contig序列,据此序列设计基因特异性引物,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术,克隆得到c DNA全长序列,分别命名为M iαCA1、M iαCA2、M iβCA1、M iβCA2和M iγCA,开放阅读框(ORF)长分别为963、1 089、1 041、738和687 bp,相应编码由320、362、346、245和228个氨基酸组成的蛋白。这些蛋白均富含疏水性氨基酸,分别占氨基酸总量的41.25%、45.31%、43.35%、42.45%和43.42%。基于缺刻缘绿藻和其他物种CA的蛋白序列所构建的Neighbor-Joining系统演化树显示,这些CA很明显地被聚类成α-、β-和γ-CA等3支。缺刻缘绿藻的2个α-CA都存在与Zn2+结合的3个His残基,2个β-CA也具有与Zn2+结合的2个Cys残基和1个His残基,但MiγCA中的Zn2+结合位点分别为Arg、His和Asn,不同于报道中的3个His。MiαCA1与莱茵衣藻的CAH3亲缘关系较近,因具有2个信号肽,它可能位于叶绿体的类囊体腔中并发挥作用。MiαCA2与莱茵衣藻的CAH1亲缘关系较近,因具有1个信号肽,可能在细胞的周质空间起着与CAH1类似的功能。M iβCA1和M iβCA2与莱茵衣藻的CAH7和CAH8亲缘关系更近,可能在细胞质中参与CO2和HCO-3之间的转化。MiγCA则与高等植物的γ-CA聚在一起,可能位于线粒体内发挥作用。由此推测,自缺刻缘绿藻所克隆的5个CA基因应在细胞的不同部位协同作用,通过参与CO2和HCO-3之间的转化以调节p H并实现CO2在细胞内转运的目的。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 莱茵衣藻 碳酸酐酶 克隆 CO2
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缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)的基因特性与功能鉴定 认领 引用 被引量：1
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作者 房逢立 吴洪 周志刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1162-1172,共11页
酰基-CoA—二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是微藻等植物三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。为了解析缺刻缘绿藻TAG合成代谢的途径,在该藻转录组测序数据库中,通过同源搜索,发现了1个编码DGAT2的cDNA全长序列。该序列长1 997 bp,其中5'-... 酰基-CoA—二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是微藻等植物三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。为了解析缺刻缘绿藻TAG合成代谢的途径,在该藻转录组测序数据库中,通过同源搜索,发现了1个编码DGAT2的cDNA全长序列。该序列长1 997 bp,其中5'-非翻译区(UTR)长44 bp,3'-UTR长897 bp,开放阅读框(ORF)长1 056 bp,编码1个含有351个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为39.43 ku,等电点为9.46。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的DGAT基因编码蛋白序列所构建的Neighbor-Joining(NJ)系统进化树,结果表明该基因与DGAT2聚成一支,显著不同于DGAT1和DGAT3。氨基酸序列比对发现,该基因编码产物含有DGAT2所具有的HPHG这4个氨基酸所组成的高度保守特征序列。因此,将该基因命名为MiDGAT2。将它的cDNA与其DNA序列进行比较后发现,MiDGAT2含有6个内含子,其剪接位点均符合"GT-AG"规则。为进一步了解其功能,利用反转录PCR克隆了该基因的ORF序列,然后将其亚克隆到表达载体pYES2中,成功地构建了重组表达质粒pY-MiDGAT2。通过电穿孔法将该重组质粒转入酿酒酵母TAG合成缺陷株H1246中,经筛选与序列验证得到含有重组质粒pY-MiDGAT2的酵母转化株。酵母转化株在用SC培养基并加入半乳糖诱导表达培养后,其脂类的薄层色谱分析结果表明,所转的MiDGAT2基因能使酵母转化株恢复TAG合成的能力,从而证实了MiDGAT2基因具有DGAT的功能;利用荧光染料Bodipy对酵母细胞的染色结果显示,MiDGAT2基因能使酵母转化株的细胞重现油滴,尽管重建的油滴大小明显比野生型酵母的小。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 酿酒酵母 二酰甘油酰基转移酶(DGAT) 三酰甘油(TAG) 油滴
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缺刻缘绿藻CDP-乙醇胺:1,2-二酰甘油乙醇胺磷酸转移酶的基因特征与功能鉴定 认领 引用
11
作者 焦建璐 封兵 +1 位作者 毕燕会 周志刚 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期123-135,共13页
运用反转录PCR与5’-及3’-末端快速扩增技术,从缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)H4301中克隆到胞苷二磷酸(CDP)-乙醇胺:二酰基甘油乙醇胺磷酸转移酶(EPT)的基因MiEPT。其cDNA序列全长1914 bp,其中,5’-非翻译区(UTR)长217 bp,3’-... 运用反转录PCR与5’-及3’-末端快速扩增技术,从缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)H4301中克隆到胞苷二磷酸(CDP)-乙醇胺:二酰基甘油乙醇胺磷酸转移酶(EPT)的基因MiEPT。其cDNA序列全长1914 bp,其中,5’-非翻译区(UTR)长217 bp,3’-UTR长533 bp,开放阅读框(ORF)长1164 bp,编码由387个氨基酸组成的蛋白。以缺刻缘绿藻基因组DNA为模板扩增到该基因的DNA序列,长为2853 bp。这两条序列的比对结果显示,MiEPT含有6个内含子,它们将其ORF分隔成7个外显子。经预测,MiEPT为含有8个跨膜区的膜整合蛋白。多序列比结果显示,MiEPT具有CDP-醇磷脂酰转移酶基序。基于不同物种EPT的氨基酸序列所构建的邻接聚类结果表明,MiEPT与已知功能的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)EPT聚类在一起,由此推测,MiEPT可以催化磷脂酰乙醇胺(PE)的生物合成。为鉴定MiEPT的基因功能,利用表达载体pET-23a实现了在大肠杆菌中重组表达MiEPT的目的。使用超离心技术,获得部分纯化含重组MiEPT的组分。体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiEPT具有EPT和胆碱磷酸转移酶(CPT)的活性。经棒状薄层色谱的定量分析,可知MiEPT的EPT酶活性是CPT的10.3倍,从而表明,MiEPT在缺刻缘绿藻中能同时参与PE和磷脂酰胆碱的生物合成,但更倾向利用CDP-乙醇胺生产PE。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 乙醇胺磷酸转移酶(EPT) 胆碱磷酸转移酶(CPT) 磷脂酰乙醇胺(PE) 磷脂酰胆碱(PC) 膜蛋白
缺刻缘绿藻Δ15脂肪酸去饱和酶的功能分析 认领 引用
12
作者 梁浩 周志刚 《上海海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1351-1360,共10页
缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)是一种富含多不饱和脂肪酸的球形单细胞淡水绿藻。在脂肪酸合成途径中,脂肪酸去饱和酶与脂肪酸酰基结合载体结合进行脂肪酸去饱和反应。为探究与缺刻缘绿藻中Δ15脂肪酸去饱和酶(fatty acid desatur... 缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)是一种富含多不饱和脂肪酸的球形单细胞淡水绿藻。在脂肪酸合成途径中,脂肪酸去饱和酶与脂肪酸酰基结合载体结合进行脂肪酸去饱和反应。为探究与缺刻缘绿藻中Δ15脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)结合的脂肪酸酰基结合载体,选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1和聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7942分别验证Δ15 FAD与酰基辅酶A(酰基-CoA)或酰基载体蛋白(酰基-ACP)结合的脂肪酸去饱和过程。根据缺刻缘绿藻的Δ15 FAD基因构建双源表达载体pYES2-Δ15 FAD和pCAMBIA1300-Δ15 FAD,通过电穿孔法将重组表达质粒分别转入酿酒酵母INVSc1和聚球藻PCC7942中,筛选得到转基因菌株。取相同细胞数的转基因酵母和转基因聚球藻,培养时分别添加等量的底物亚油酸(linoleic acid, 18∶2Δ9,12,LA),以LA作为酰基受体,使其进入转基因酵母和转基因聚球藻的生物合成途径中,培养36~72 h。利用气相色谱-质谱联用系统对总脂肪酸的各组分进行分析,结果显示,在转基因实验组中检测到LA和α-亚麻酸(α-linolenic acid, 18∶3Δ9,12,15,ALA)的存在,空白实验则未检测出相应的产物。通过计算,转基因酵母催化LA生成ALA的效率为29.31%,转基因聚球藻催化底物LA生成ALA的效率为30.86%。结果证明无论是酰基-ACP还是酰基-CoA,与缺刻缘绿藻中的Δ15 FAD结合进行反应的效率相近,不存在偏好性,由于Δ15 FAD是特异性蛋白,因此证明缺刻缘绿藻中的Δ15 FAD属于脂酰基结合蛋白。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 Δ15脂肪酸去饱和酶 酿酒酵母 聚球藻 脂肪酸 气相质谱联用
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编码缺刻缘绿藻乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基的基因克隆与表达分析 认领 引用
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作者 李燕 周志刚 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期794-802,共9页
为了探讨在氮饥饿对缺刻缘绿藻花生四烯酸(ArA)合成与积累的影响,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和设计简并引物进行反转录(RT)-PCR扩增,克隆了编码该藻异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的2个生物素羧基载体蛋白(BCCP)的基因序列。其中MiBCCP... 为了探讨在氮饥饿对缺刻缘绿藻花生四烯酸(ArA)合成与积累的影响,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和设计简并引物进行反转录(RT)-PCR扩增,克隆了编码该藻异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的2个生物素羧基载体蛋白(BCCP)的基因序列。其中MiBCCP1基因的cDNA序列长1 267 bp,包含的5'-非翻译区(UTR)长44 bp,3'-UTR长524 bp,开放阅读框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸并含有45个氨基酸序列的叶绿体定位信号肽;预测成熟蛋白分子量约为20 ku。MiBCCP2基因的ORF长789 bp,编码263个氨基酸并含有49个氨基酸的叶绿体定位信号肽,推测成熟蛋白分子量约为22 ku,但其羧基端缺乏生物素酰基化位点。邻接法(NJ)构建的聚类图显示它们分属于2个不同的分支(靴带值为100)。采用半定量反转录(RT)-PCR技术分析这2个基因的表达量,结果显示,在氮饥饿光照培养条件下,它们的相对转录量都先短暂升高然后持续下调,从而表明缺刻缘绿藻脂肪酸的从头合成能力有下降的趋势。结合该藻的ArA含量在该培养条件下明显增加的结果,推测胞质中同质型ACCase对缺刻缘绿藻ArA合成与积累起着更重要的作用。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 乙酰辅酶A羧化酶 生物素羧基载体蛋白(BCCP) 氮饥饿 半定量反转录PCR
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缺刻缘绿藻总RNA提取方法的比较研究 认领 引用 被引量：15
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作者 杜道海 周志刚 《华北农学报》 北大核心 2008年第B10期103-106,共4页
为了获得高质量的缺刻缘绿藻总RNA,采用CTAB法、TRIzol法和RNAplant法3种方法对该藻总RNA的提取效果进行比较分析。结果表明,采用CTAB法提取获得的总RNA产率最高,但因可能含有较多的蛋白质、多糖等杂质使得纯度最低;TRIzol法提取的总RN... 为了获得高质量的缺刻缘绿藻总RNA,采用CTAB法、TRIzol法和RNAplant法3种方法对该藻总RNA的提取效果进行比较分析。结果表明,采用CTAB法提取获得的总RNA产率最高,但因可能含有较多的蛋白质、多糖等杂质使得纯度最低;TRIzol法提取的总RNA纯度较CTAB法稍高,但产率最低,且仍含有DNA带;RNAplant法提取的总RNA电泳图清晰,OD260nm/OD280nm值为2.0,高于前2种方法,产率在2种方法之间,表明RNAplant法更适于缺刻缘绿藻总RNA的提取。对后者提取的总RNA,经反转录合成的cDNA产物大小在500 bp^2 kb,并能通过RT-PCR获得18 SrRNA基因的特异性片段,进一步说明利用RNAplant法可为基因克隆、表达分析等后续研究提供高质量的RNA。 展开更多
关键词 缺刻缘绿藻 RNA提取 反转录聚合酶链式反应
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